Zawartość
Lise to greckie słowo, które oznacza po prostu „dzielić” lub „rozkładać”. Jest to dobry opis reakcji, która zachodzi z komórkami w buforze do lizy, roztworze, który rozbija je w celu wyodrębnienia ich zawartości. Naukowcy wykorzystują te roztwory do ekstrakcji DNA lub białek w analizie komórek, zwłaszcza w przypadku bakterii. Rodzaj buforu do lizy komórek różni się w zależności od rodzaju eksperymentu, jednak wspomnimy o kilku typowych wyborach.
Bufor i sól
Roztwory buforowe stabilizują pH, podczas gdy komórki przechodzą proces lizy. Roztwór tris-HCL jest najpowszechniejszym buforem do buforowania przy pH 8, jeśli pH jest pożądane. HEPES jest kolejnym popularnym roztworem buforowym w tych eksperymentach. W celu zwiększenia siły jonowej, czyli całkowitego stężenia substancji rozpuszczonych poza komórkami, można również dodać chlorek sodu. To ostatnie jest ważne, ponieważ woda może rozprzestrzeniać się na wszystkie błony komórkowe, od regionów o niskim stężeniu substancji rozpuszczonych do tych o wysokim stężeniu.
Detergent
Detergent jest głównym składnikiem rozpuszczającym błonę komórkową, umożliwiając ucieczkę zawartości. Detergenty są amfipatycznymi cząsteczkami, to znaczy z jednym końcem, który łatwo oddziałuje z cząsteczkami wody, podczas gdy drugi hydrofobowy koniec, „który boi się wody”, nie powoduje takiej interakcji. Mogą rozpuszczać tłuszcze, tworząc micele, małe grupy, w których hydrofobowe ogony cząsteczek detergentu są skierowane do wewnątrz cząsteczek tłuszczu. Typowymi detergentami są dodecylosiarczan sodu lub SDS, NP-40 i tritonX.
Środki chelatujące i inhibitory
Bufory do lizy zwykle zawierają również czynniki chelatujące, takie jak kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) lub kwas retyleno-glikolotetraoctowy (EGTA). Te chemikalia wiążą się z jonami metali z ładunkiem +2 (na przykład magnez i wapń), przez co stają się niedostępne dla innych reakcji. Wiele DNAzy (białka, które żują DNA) i proteaz (białka, które tną inne białka) potrzebują do działania jonów magnezu, więc pozbawiając je tego głównego składnika, EDTA i EGTA, pomagają obniżyć poziom proteazy lub aktywności DNAzy. Jednak nie wykluczają ich całkowicie, a niektóre proteazy nie są zależne od kofaktorów magnezu, dlatego bufory lizujące czasami zawierają również substancje zwane inhibitorami proteazy, które wiążą się z nią i uniemożliwiają jej prawidłowe działanie.
Liza alkaliczna
Liza alkaliczna jest bardzo powszechną techniką oczyszczania plazmidów z bakterii. Ta metoda zakłada użycie trzech rozwiązań. Pierwsza zawiera glukozę, bufor Tris-HCL, EDTA i RNAzy. Glukoza tworzy wysokie stężenie rozpuszczonych bakterii zewnętrznych, przez co stają się one lekko wiotkie, co ułatwia proces lizy. EDTA i tris-HCL działają tak, jak opisano wcześniej, podczas gdy RNAza przeżuwa RNA wewnątrz komórki, aby usunąć je z drogi. Drugie rozwiązanie skutecznie powoduje lizę komórek. Zawiera detergent SDS i NaOH, który podnosi pH do 12 lub więcej, denaturując białka wewnątrz komórki i powodując rozdzielenie DNA na proste włókna. Trzeci roztwór zawiera octan potasu, aby przywrócić pH do bardziej neutralnego poziomu, tak aby nici plazmidowego DNA mogły się połączyć. W międzyczasie zdenaturowane białka łączą się i wytrącają, podczas gdy jony dodecylosiarczanu łączą się z jonami potasu, tworząc nierozpuszczalny związek, który również może wytrącać się z roztworu.