Zawartość
- Wykrywanie za pomocą zmian kolorów
- Wykorzystanie czytnika ELISA do pomiaru
- Bezpośredni konkurencyjny test ELISA (cytochrom c)
- Inkubować pierwotne przeciwciało w probówkach
Test ELISA jest enzymatycznym testem immunosorbcyjnym, w którym wykorzystuje się przeciwciała lub antygeny sprzężone ze specyficznym enzymem, aby pomóc określić stężenie przeciwciała lub antygenu. Jeśli stosujesz test ELISA i nie możesz użyć swoistych przeciwciał w celu uzyskania wyników, sugeruje się kompetycyjny test ELISA, ponieważ wykorzystuje on antygen skoniugowany z enzymem zamiast przeciwciała i inną metodę wykrywania.
Wykrywanie za pomocą zmian kolorów
Powszechnym protokołem dla kompetycyjnego testu ELISA jest użycie nieznakowanego i oczyszczonego pierwszorzędowego przeciwciała. Przeciwciało pokrywa studzienki płytki mikrotitracyjnej i jest inkubowane z nieznanymi standardami. Następnie dodaje się immunogen do koniugatu z pierwszorzędowym przeciwciałem, które wiąże się z miejscami przeciwciała, które nie są jeszcze zajęte. Substrat jest następnie wykorzystywany do zmiany koloru w celu zmierzenia stężenia wiązania.
Wykorzystanie czytnika ELISA do pomiaru
Użyj płytki polistyrenowej do mikromiareczkowania i dodaj pierwszorzędowe przeciwciało do każdego dołka. Aby osiągnąć maksymalne wiązanie, wypełnij studzienkę jednym mikrogramem przeciwciała. Inkubować płytkę przez cztery godziny w temperaturze pokojowej. Dodaj pierwszorzędowe przeciwciało wychwytujące i przemyj studzienki PBS (solanka buforowana fosforanem). Inkubować płytki z buforem blokującym przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Ponownie umyj studzienki PBS i dodaj standardy. Umieść roztwór koniugatu antygenu w studzienkach i ponownie inkubuj przez dwie godziny. Ponownie umyj płytkę PBS cztery razy. Dodaj substrat i zmierz gęstość przy określonej długości fali za pomocą czytnika ELISA.
Bezpośredni konkurencyjny test ELISA (cytochrom c)
W przypadku bezpośredniego konkurencyjnego testu ELISA należy przeprowadzić analizę rozcieńczenia surowicy dla antygenu, którego używasz w eksperymencie. Płytkę do mikromiareczkowania powleka się następnie cytochromem c i inkubuje przez noc. Część testu ELISA przeprowadza się następnie przez dodanie odczynnika blokującego i przeciwciała drugorzędowego. Wyniki absorbancji odczytuje się za pomocą czytnika mikropłytek.
Inkubować pierwotne przeciwciało w probówkach
W tej procedurze pierwszorzędowe przeciwciało jest inkubowane w probówkach testowych, z którymi wiąże się antygen będący przedmiotem zainteresowania. Próbki następnie dodaje się do studzienek płytek do mikromiareczkowania i inkubuje. Studzienki następnie przemywa się w celu usunięcia wszelkich niezwiązanych kompleksów antygen-przeciwciało, a następnie dodaje się roztwór blokujący, aby zapobiec związaniu drugiego przeciwciała ze studzienkami. Wtórne przeciwciało jest następnie odczytywane na czytniku płytek w celu uzyskania wyników.